Preimplantační diagnóza (PGD) diagnostika dědičných onemocnění a embryí / Reprodukologie

Genetické testování je metoda, která se používá k diagnostice dědičných defektů embryí získaných in vitro fertilizací před těhotenstvím. Předimplantační diagnostika (PGD) je alternativou k amniocentéze a biopsii chorionického vilu, která je často následována obtížným rozhodnutím ukončit těhotenství, pokud jsou výsledky nepříznivé.. Dnes je PGD jedinou možností, jak zabránit vysokému riziku vzniku dítěte s genetickými onemocněními..

V jakých případech se PGD provádí v případě genetických patologií

Indikace předimplantační diagnostiky podle genetiky:
Nosič autosomálních recesivních onemocnění;
Patologie spojená s chromozómem X;
Páry s významnými chromosomálními translokacemi, které interferují s implantací, vyvolávají potraty nebo vyvolávají duševní nebo fyzické problémy u potomstva;
Nositel autosomálních dominantních nemocí.

Předimplantační diagnóza se používá pro patologická onemocnění související s pohlavím, defekty jednoho genu a chromozomální poruchy..

Sexuální zneužívání

X-spojená onemocnění jsou přenášena na dítě přes matku, která je nositelem. Patologický chromozóm X způsobuje onemocnění u synů, kteří z otce nezdědí normální chromozom X, ale dostanou Y chromozom. V budoucnu se očekává narození zdravých chlapců, ale pravděpodobnost přepravy dcer je 50% za předpokladu, že zdraví matky.

Je důležité

Nemoci spojené s chromozomem X nejsou nikdy přenášeny z otce na syna.

Autozomální recesivní patologie zahrnuje hemofilii, většinu neuromuskulárních dystrofií a stovky dalších onemocnění..

Autozomální dominantní poruchy se projeví jako rettový syndrom, pseudo-hyperparatyreóza, rachita rezistentní na vitamin D, Bloch-Sulzbergerův syndrom (dědičná porucha pigmentace kůže s patologií zraku, zuby a centrální nervový systém) atd..

Y chromozóm nese zanedbatelný počet genů, ale některé patologie sexuální diferenciace jsou s tím spojeny..

U těžkých forem zhoršené spermatogeneze (kriticky malého počtu nebo úplné absence samčích zárodečných buněk) v 18% případů jsou mikrodelece diagnostikovány v genu faktoru azoospermie umístěném na dlouhém ramene chromozomu U.

Jediné vady genu

PGD se používá k identifikaci jednotlivých defektů genu, které způsobují řadu onemocnění:

Cystická fibróza;
Thajská Sachsova choroba;
Srpkovitá anémie;
Huntingtonova choroba.

S těmito patologiemi genetická diagnostika detekuje defekt pomocí molekulárních metod za použití amplifikace (polymerázové řetězové reakce (PCR) amplifikace (multiple replikace) DNA z jedné buňky.

Chromozomální poruchy

Translokace, inverze a delece vedou k poškození chromozomu, který lze detekovat fluorescenční hybridizací. U některých párů jsou šance na životaschopné těhotenství bez PGD zanedbatelné, protože předchozí pokusy vedly k vzniku embryí s chromozomální mutací a skončily spontánními potraty.

Předimplantační genetické vyšetření: relativní indikace

Podle studií je většina předčasných těhotenských potratů způsobena aneuploidií, porušením počtu chromozomů. Vzhledem k tomu, že zdravé embrya jsou přeneseny do dělohy, pravděpodobnost potratu v prvním a druhém trimestru klesá.

V současné době neexistuje žádný konkrétní seznam indikací pro PGD.

Preimplantační genetické screening je považován za žádoucí v následujících případech:

Plánované těhotenství u starší ženy.
Zatěžovaná porodnická a gynekologická historie s opakovanými potraty.
Neúspěšné opakované pokusy IVF, včetně metody ICSI.
Těžký faktor neplodnosti u mužů.

Dokázaná skutečnost, že se riziko aneuploidie zvyšuje s věkem. Chromozomy jsou méně pravděpodobné, že se správně rozdělí, což vede k dalšímu nebo nepřítomnému chromozómu v embryu. Patologický počet chromozomů je u matky ve věku 35-39 let vyšší než 20% a ve věku 40 let a starších dosahuje 40%.

Frekvence aneuploidie u dětí narozených matkám ve věku 35-39 let - 0,6-1,4%, starších 39 let - 1,6-10%.

Je důležité

Ne všechna těhotenství končí při narození životaschopného dítěte, někdy dochází k samočinnému přerušení, než žena může být podezřelá z jejího stavu..

Příkladem časté aneuploidie je trisomie 21 chromozomu, která vede k Downovmu syndromu. Frekvence trisomie 21 v životaschopném plodu byla stanovena v závislosti na věku matky. Podle výsledků je optimální věk pro narození dítěte ve věku 20-24 let (nejnižší riziko je 1/1400). Ve věku 40 - 1/100, starších 45 let - 1/25.

Opakované potraty a diagnostika PGD

Pokud má žena dvě nebo více po sobě jdoucích přerušení těhotenství po dobu až 20 týdnů, je PGD oprávněná před IVF. Příčina je často neznámá, ale chromozomální abnormality u potratovaných embryí jsou diagnostikovány v 50-80%.

Dávejte pozor

Studie ukázaly, že páry s více potraty podléhají vyššímu procentu aneuploidních embryí..

Neúspěch IVF několikrát za sebou

Tři nebo více neúspěšných pokusů IVF zahrnujících vysoce kvalitní embrya může naznačovat chromozomální abnormality. Navíc stojí za zmínku o imunologických a děložních faktorech, které přispívají k narušení implantace..

Faktor mužské neplodnosti

Mužský hypogonadismus vede k tvorbě embryí s chromozomálními abnormalitami. V normálním spermatu je přítomno asi 3-8% nemocných spermií. Jejich počet se významně zvyšuje u mužů s těžkou neplodností (pokles počtu, špatná morfologie a zhoršená motorická aktivita) na 27-74%.

Při použití intracytoplazmatického vstřikování spermií do vaječných buněk špatná kvalita spermií již není překážkou pro koncepci biologicky přirozeného dítěte. Bylo zjištěno, že různé genetické vady jsou spojeny s mužským faktorem neplodnosti. Častěji se jedná o aneuploidii, Klinefelterově syndrom, mikrodisku chromozomu Y, poškození androgenního receptoru a další mutace autosomálních genů (cystická fibróza).

Je důležité

Během postupu ICSI se vypne přirozený výběr, takže se zvyšuje riziko přenosu genetických mutací na potomstvo.

Výběr sexu

PGD může určit pohlaví embrya, ale touha porodit chlapec nebo dívku bez důkazů (genetické nemoci spojené se sexem) není etický.

Soulad s humánním leukocytovým antigenem (HLA)

Mezi nové indikace PGD patří srovnání HLA. Tato metoda může být použita k vyloučení genetické patologie. V situacích, kdy rodina již má dítě s recesivním onemocněním a je nutná léčba transplantací kmenových buněk nebo kostní dřeně (talasemie, leukémie), Je možné zvolit "vhodné" embryo, které se po porodu stane dárcem pro proband (bratr nebo sestra). První případ je popsán příkladem rodiny s dítětem trpícím Fanconi anémií a PGD byla provedena k výběru zdravého embrya se stejným typem HLA jako nemocný bratr. Použití PGD v takových situacích je diskutabilní z morálních a etických důvodů..

Předimplantační diagnóza: jak se dělá a jaké jsou způsoby

Páry v rizikové zóně jsou konzultovány genetikem, který posuzuje riziko přenosu genetické patologie. Proveďte testy, které potvrdí diagnózu jednoho z rodičů. V závislosti na genetické nemoci je vybrána diagnostická metoda, pomocí které lze identifikovat změny embrya..

Pro získání biomateriálu pro PGD se používá pouze IVF.. Ve třetím nebo pátém dni po hnojení se extrahuje požadovaný biomateriál. Genetická analýza před transplantací se provádí pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), fluorescenční hybridizace (FISH), srovnávací genomové hybridizace (CGH) a NGS testování.

Zdravé embrya se přenášejí do dělohy (zpravidla ne více než 2), zatímco ostatní jsou vitrifikovány. Rychlé zamrznutí umožňuje jejich použití v následujících cyklech IVF.

PCR

PCR se používá k diagnostice jednotlivých genových defektů, včetně dominantních a recesivních poruch.. PCR (někdy nazývaná amplifikace DNA) je metoda, při které je určitá sekvence mnohokrát kopírována, což umožňuje analýzu.

Pro přesnou diagnózu potřebujete vysoce kvalitní vzorek DNA, který je obtížné získat z jedné buňky..

Chyby PCR analýzy mohou vést k přenosu nekvalitní embrya u 11% autozomálně dominantní patologie a u 2% u recesivních.

Polymerázová řetězová reakce vám umožňuje určit případnou diagnózu:

Vady jednoho genu při autosomální nemoci;
Jednorázová patologie genů u mužské neplodnosti;
Identifikace pohlaví u chorob souvisejících s X.

Fluorescenční hybridizace (FISH)

FISH se používá k určení pohlaví pro choroby spojené s X, chromozomální abnormalitou a aneuploidií.

Sondy, které představují malé fragmenty DNA odpovídající analyzovaným chromozomům, se vážou na "svůj" chromozom. Každá sonda má vlastní barvivo. Proces je vizualizován pod fluorescenčním mikroskopem. Počet chromozomů každé barvy je počítán a vyvozeny jsou závěry..

Fluorescenční in situ hybridizace je v případě potřeby opodstatněná:

Aneuploidní screening u žen starších 38-39 let;
Počítání počtu chromozomů u mužské neplodnosti;
Identifikace pohlaví u onemocnění souvisejících s X;
Diagnostika rodičovských translokací, která vedla k opakovaným opakovaným potratům.

Srovnávací genomová hybridizace (CGH, SHG)

Lidská buňka obsahuje 23 párů chromozomů; analýza FISH však umožňuje přesné vyhodnocení pouze 7 až 9 chromozomů v každé získané buňce. V důsledku toho zůstává mnoho abnormálních embryí nezjištěných a může být použito při přenosu.

Při provádění srovnávací genomové hybridizace je testovaná DNA ošetřena fluorescenčním barvivem (zeleným) a pro vzorku je použita červená barva. Pak dvě buňky hybridizují a porovnává se poměr mezi dvěma barvami. Pokud chromozomální analýza ukazuje přebytek červené, embryonální jádro obsahuje další chromozom. Pokud je nadbytek zelené barvy, z jádra embrya chybí jeden z chromozomů.. SHS umožňuje nejen vyhodnotit všechny 23 chromozomů, ale také dává podrobnější obrázek o délce, která může odhalit nerovnováhu chromozomálních segmentů..

Tato metoda v současné době trvá 72 hodin. Vzhledem k omezené životnosti embryí v kultivačním médiu je nutná vitrifikace embryí. I při vysokém přežití může kryokonzervace vést k 30% ztrátě životaschopných embryí..

Dávejte pozor

Ve velkých reprodukčních klubech již pracují na akcelerovaných protokolech SHG, kde se výsledky objevují po 24 hodinách, což umožňuje, aby se nezjistil optimální čas přenosu.

NGS testování

Metoda zahrnuje stanovení sekvence nukleotidů (základní struktury dědičného materiálu) v RNA a DNA.

Mezi výhody patří:

schopnost posoudit užitečnost / defekty všech chromozomů;
minimalizace chyb v důsledku automatizace procesů;
simultánní dekódování více sekvencí;
opakovaná analýza lokusu genetického kódu;
vysoká citlivost a přesnost;
minimalizace chybného závěru (0,001%);
atraumatická pro embryo;
zvyšují šance na úspěšné IVF.

Absolutní indikace pro NGS: přenos chromozomální abnormality u rodičů nebo rodu, genetické onemocnění spojená se sexem.

Předimplantační studie NGS zahrnuje následující kroky:

biopsie embrya ve stádiu blastocysty, častěji biopsie trophoectodermu;
izolace molekul nukleových kyselin;
vytvoření základny pro následné genetické testování,
amplifikaci pro získání amplikonů metodou PCR, které jsou vzaty jako vzorek;
počítačová vizualizace primárního modelu DNA / RNA jako výsledek vícečetné analýzy neparalelních fragmentů.

Specialista hodnotí počítačovou grafiku, která ukazuje patologii ve formě poklesů nebo špiček.

Na základě testu NGS se embrya s nízkou vitalitou nebo s klinicky výraznými mutacemi odmítnou a zbytek po rozmrazení se používá v IVF protokolech.

Ne všechny reprodukční kliniky provádějí tuto analýzu..

Je důležité

Předimplantační diagnostika není zahrnuta v seznamu služeb pro povinné zdravotní pojištění a je placena pacientem.

Co je zkoumáno s PGD

Většina klinik provádí biopsii embryí ve fázi štěpení, ale pro PGD lze použít jednu ze tří metod.

Biopsie polárního těla

Metoda je vhodná pro detekci genetické patologie u ženy, jelikož se odhaduje počet chromozomů ve vaječné buňce. Biopsie polárního těla neumožňuje získat informace o chromozomální struktuře budoucího embrya, protože od otce dostane druhou polovinu genetického materiálu. Tato metoda je zřídka používána..

Biopsie embrya s hedcí

Nejčastější metodou PGD je studium jediného blastoméru získaného z embrya, který se vyvíjí 3. den. Užívání blastomery je technicky náročný postup, provádí se pomocí speciálního mikroskopu a mikromanipulátorů. Cíl - odstranění požadovaných buněk s minimálním traumatem embrya.

V den 3 vývoje se embryo skládá z 6 až 10 buněk a před manipulací se udržuje ve speciálním prostředí po dobu 20 minut, aby se snížilo lepení blastomerů. Pak je embryo fixováno a v oblasti pellucida vzniká otvor, který otevírá přístup k blastomerem. Tento postup se nazývá "šrafování" a může být prováděn pomocí roztoku kyseliny, laserem nebo mechanicky. Do otvoru se vloží pipeta, která se zaměřuje na vybraný blastomér s viditelným jádrem. Aspirací je blastomér extrahován a zpracován pro FISH nebo PCR (diagnóza PCR), v závislosti na genetické patologii. Embryo je ponořeno do vhodného kultivačního média..

Nevýhody této metody zahrnují skutečnost, že embryo může být mozaika a pro genetickou analýzu existuje pravděpodobnost odstranění "zdravého" blastoméru.

Blastocystová biopsie

Tvorba blastocysty začíná pátým dnem a je určena akumulací vnitřní a vnější buněčné hmoty. V této fázi se embryo skládá z přibližně 100 buněk. Prostřednictvím otvoru jsou buňky odebrány z trophoectodermu pomocí tenké pipety s biopsií. Vnitřní buněčná hmota není zraněna. Genetická analýza se provádí za použití FISH nebo PCR.

Omezení diagnostického postupu - embryo mozaika a požadovaný čas pro studium - 24-48 hodin, což výrazně snižuje životaschopnost a narušuje implantaci.

Jedinou cestou je zmrazení biomateriálu, po němž kvalita embryí trpí mírně.

PGD se ve většině případů dokončí do 24 hodin po provedení biopsie, což vám umožní provést přenos v den 4 nebo 5.

Dávejte pozor

Většina klinik analyzuje 24 chromozomů (22 autozomů a 2 pohlavních chromozomů) za použití srovnávací genomové hybridizace na embryo dosahujícího 5 dnů věku..

Výhody a nevýhody genetické analýzy u 3-denních a 5-denních embryí

Tři dny:

větší riziko zranění (přibližně 15%, důležitá role, kterou hraje kvalifikace embryologa);
schopnost provádět analýzu pouze u 9 chromozomů, včetně pouze nejběžnějších dědičných onemocnění;
pravděpodobnost biochemických a zmeškaných potratů způsobených patologií v nezpracovaných chromozomech;
mozaika.

Pět dní:

životaschopnost embryí klesá, jelikož existují mimo tělo matky, je potřeba čekat na provedení biopsie (je možné předčasný blastocyst podrobit vitrifikaci nebo přenosu);
zastavení vývoje "dobrých" embryí nesouvisejících s genetickými faktory;
možnost provést komplexní chromozomální analýzu;
nízké riziko poškození embrya (přibližně 5%).

Je důležité

Špatně kvalitní embrya jsou odmítnuta, pokud došlo k jejich přenosu, těhotenství buď nedošlo nebo skončilo s vývojem nebo se samočinným přerušením v počáteční fázi.

Jaký je nejlepší způsob, jak PGD?

Odborníci se domnívají, že srovnávací genomová hybridizace je lepší než

FISH diagnostika, jelikož možnosti této metody jsou širší a riziko zranění embrya je menší. Se zvláštnostmi karyotypu rodiče (například translokace) existuje možnost interchromozomálního efektu spojujícího - riziko nesprávné odchylky jakýchkoli chromozomů, a to nejen těch, které jsou poškozené a diagnostikované během karyotypu u matky nebo otce.

Nevýhody zahrnují potřebu kryokonzervace a vysoké náklady.

Výzkum FISH je vhodnější než PCR, protože polymerázová reakce nese riziko nesprávné diagnostiky v důsledku biologické kontaminace..

Dnes nejúčinnější metoda - NGS - sekvenování nové generace.

Mishina Victoria, urolog, lékařský referent